Covid 19 hay Sar Cov 2 hiện đang trở thành mối đe dọa toàn cầu, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe, tính mạng của hàng trăm triệu người trên khắp thế giới, làm suy kiệt nền kinh tế của hầu khắp các nước. Bởi thế, việc nghiên cứu, phòng chống Sar Cov 2 đang trở thành ưu tiên hàng đầu của ngành y tế thế giới. Mới đây, vào cuối năm 2020, Cơ quan quản lý dược phẩm và thực phẩm Mỹ (FDA) đã cho phép dùng Cordycepin trong đông trùng hạ thảo nuôi cấy để chữa Sars – Cov -2. Dưới đây là bản dịch của nghiên cứu này.

Giới thiệu

Bệnh COVID-19 gây ra bởi RNA sợi đơn, có giác quan dương có chứa coronavirus mới, được đặt tên là coronavirus hội chứng hô hấp cấp tính nghiêm trọng 2 (SARS ‐ CoV ‐ 2) (trước đây tạm gọi là covid 19, coronavirus mới 2019; 2019 ‐ nCoV). Virus, hiện đang là đại dịch, đã lây nhiễm cho ít nhất 109 triệu người trên khắp thế giới, làm chết 2,4 triệu người (cho đến ngày 21 tháng  2 năm 2021). Các triệu chứng lâm sàng liên quan đến COVID ‐ 19 bao gồm sốt cao, ho nhẹ, đau người, không ngửi và nếm, tự giới hạn bệnh đường hô hấp thành viêm phổi tiến triển nặng dẫn đến suy đa phủ tạng dẫn đến tử vong.

Đại dịch COVID-19 đặt ra một thách thức lớn trong tương lai gần đối với sức khỏe cộng đồng toàn cầu, kêu gọi sự phát triển của các phương pháp điều trị và dự phòng hiệu quả chống lại tác nhân gây bệnh. Do không có (các) loại thuốc kháng vi-rút mạnh để điều trị bệnh nhân COVID-19 dẫn đến việc yêu cầu thử nghiệm các loại thuốc kháng vi-rút hiện có (một mình hoặc kết hợp) đã được phê duyệt trước đây để sử dụng các vi-rút gần gũi về mặt di truyền của con người. Việc sử dụng lại thuốc hoặc tái định vị các loại thuốc đã ra mắt hoặc thậm chí đã thất bại trong quá trình chống lại các bệnh do virus mới xuất hiện. Việc làm đúng đắn nhất là kịp thời dùng phương pháp nghiên cứu ra thuốc mới bằng phương pháp dịch mã, phương pháp này mang lại xác suất thành công cao hơn đáng kể so với việc phát triển các loại thuốc và vắc xin đặc trị virus mới, xét về chi phí, thời gian và tính khả dụng trên lâm sàng.

Bộ gen SARS ‐ CoV ‐ 2 bao gồm 6 khung đọc mở và mã cho một số protein cấu trúc và không cấu trúc. Protein cấu trúc bao gồm protein gai (S), protein màng (M), protein vỏ (E) và protein nucleocapsid (Ncp) liên kết chặt chẽ với bề mặt của virion trưởng thành. Protein Spike ( S) được tạo thành từ hai tiểu đơn vị chức năng riêng biệt (S 1 và S 2 ) chịu trách nhiệm liên kết ( tiểu đơn vị S 1 ) và dung hợp ( tiểu đơn vị S 2 ) với màng tế bào chủ. S 1 xatiểu đơn vị chứa vùng liên kết thụ thể và ổn định trạng thái trước tưới máu của tiểu đơn vị S 2 cố định màng chứa bộ máy dung hợp. Đối với tất cả CoV, S tiếp tục được phân cắt và xử lý bởi protease vật chủ, TMPRSS2 tại vị trí S 2 ′ và trong một nghiên cứu gần đây, người ta đã báo cáo rằng chất ức chế protease serine, hoạt động trên TMPRSS2 ức chế đáng kể lây nhiễm coronavirus mới. Do đó, rõ ràng là sự xâm nhập của coronavirus vào các tế bào nhạy cảm là một quá trình phức tạp và nhiều bước đòi hỏi hoạt động phối hợp của quá trình liên kết thụ thể và phân giải protein của protein đột biến để thúc đẩy quá trình hợp nhất tế bào virus thành công.

Hơn nữa, sự trưởng thành của SARS ‐ CoV ‐ 2 cũng đòi hỏi một loạt các sự kiện phân giải protein rất phức tạp qua trung gian của protease chính (CoV M pro ; còn được gọi là 3Cl protease hoặc 3CL pro ) trên các polyprotein để kiểm soát sự biểu hiện gen của virus corona. M pro (~ 306 axit amin) là một protease cysteine ​​với chymotrypsin giống như nếp gấp hai miền ở đầu cuối N bao gồm ba miền chức năng (I ‐ III). Phân tích cấu trúc của M pro cho thấy rằng hai phân tử M pro tạo thành một homodimer hoạt động. A Cys được định vị trong một khe nằm giữa miền I và II, và M proCác gốc đầu cuối N chủ yếu từ 1 đến 7 tham gia vào hoạt động phân giải protein, trong khi vùng đầu cuối C III được báo cáo là cần thiết cho quá trình đồng phân hóa. Hầu hết các sự kiện phân cắt trưởng thành trong polyprotein tiền thân là do protease chính CoV làm trung gian để ngăn chặn sự lây lan của bệnh tật bằng cách hạn chế sự phân cắt của polyprotein virus.

Cho đến nay, không có thuốc kháng vi rút đã được chứng minh lâm sàng để điều trị đại dịch COVID-19. Do tình hình nghiêm trọng và sự lây lan nhanh chóng trên toàn thế giới của SARS ‐ CoV ‐ 2, cần có những nỗ lực khẩn cấp và bổ sung để tìm ra các phương pháp phòng ngừa mới. Sự kết hợp giữa α-interferon và thuốc chống HIV Lopinavir / Ritonavir (Kaletra®) đã được thử nghiệm ở các mức độ nhiễm trùng khác nhau, nhưng hiệu quả điều trị bị hạn chế do tác dụng phụ nghiêm trọng trên vật chủ. Một loại thuốc kháng vi-rút phổ rộng, remdesivir, (của Gilead Sciences, Inc.) cũng đang trong cuộc đua thử nghiệm để điều trị COVID-19, nhưng thiếu dữ liệu thỏa đáng để chứng minh hiệu quả của nó. Cũng cần nhắc lại rằng, Hội đồng Nghiên cứu Y khoa Ấn Độ (ICMR), thuộc Bộ Y tế và Phúc lợi Gia đình (MHFW), đã khuyến nghị sử dụng hydroxychloroquine (400 mg hai lần vào ngày 1, sau đó 400 mg một lần một tuần sau đó) như dự phòng hóa học cho các nhân viên y tế không có triệu chứng trực tiếp tham gia điều trị COVID ‐ 19 bệnh nhân nghi ngờ hoặc xác nhận COVID ‐ 19, và cho những người tiếp xúc với hộ gia đình không có triệu chứng của các trường hợp được xác nhận ( F1,F2,F3).

Do đó, dữ liệu hiện có đã xác nhận rằng protein đột biến (S) và protease chính (M pro ) trong SARS ‐ CoV ‐ 2 đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập của virus, sao chép bộ gen và tự nhân lên trong cơ thể vật chủ. Do đó, trong nghiên cứu này, các mục tiêu protein này đã được sử dụng trong quá trình mô phỏng tương tác phân tử với các loại thuốc điều tra và được FDA chấp thuận bằng cách sử dụng các công cụ tính toán khác nhau. Bài báo này nêu bật tiềm năng thay thế của các ứng cử viên thuốc kháng vi-rút đã biết chống lại SARS ‐ CoV ‐ 2.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Lựa chọn và thu nhận các hợp chất hóa học

Thông tin về các tác nhân kháng vi-rút phổ rộng (BSAA, tức là các hợp chất nhắm vào các vi-rút thuộc hai hoặc nhiều họ vi-rút) được thu thập từ cơ sở dữ liệu có thể truy cập miễn phí ( drugvirus) của Andersen và cộng sự. Các phân tử thuốc được chọn thuộc danh mục điều tra hoặc được FDA chấp thuận chống lại SARS ‐ CoV ‐ 2, HCoV ‐ 229E, HCoV ‐ OC43, MERS ‐ CoV, và SARS ‐ CoV cũng như các bệnh ở người khác. Bốn mươi lăm ứng cử viên thuốc tiềm năng như trong Bảng 1 đã được xác định từ tài liệu PubMed ‐ NCBI có hoạt tính kháng vi rút mạnh chống lại các vi rút gần gũi về mặt di truyền của con người. Tình trạng hiện tại của tất cả các ứng cử viên thuốc chống lại protein mục tiêu SARS ‐ CoV ‐ 2 cũng được trình bày trong Bảng  2. Các cấu trúc 3D của tất cả các hợp chất đã được tải xuống ở định dạng tệp SDF / Mol được nhúng với các thuộc tính 3D từ cơ sở dữ liệu hợp chất PubChem, DrugBank và cơ sở dữ liệu ZINC. Sự sắp xếp phân tử và hình học của tất cả các hợp chất đã được tối ưu hóa hoàn toàn bằng cách sử dụng phương pháp hóa học lượng tử bán thực nghiệm (PM3). Cuối cùng, cấu trúc 3D được tối ưu hóa hoàn toàn của tất cả các phân tử thuốc đã được xuất ở định dạng Mol2 và được sử dụng để mô phỏng tương tác phân tử bằng các công cụ tính toán khác nhau.

BẢNG 1. Chi tiết về các ứng cử viên thuốc chữa Covid 19 với chú thích chức năng của chúng được sử dụng trong nghiên cứu hiện tại cho các mô phỏng tương tác phân tử dựa trên mục tiêu.

STTTÊN THUỐCCHỈ ĐỊNH CHÍNHVI-RÚTNHÓMPHƯƠNG THỨC HÀNH ĐỘNGIC 50 (ΜM)IC 50 ĐƯỢC BÁO CÁO CHỐNG LẠIPUBCHEM AID / HỒ SƠ XÉT NGHIỆM SINH HỌC / TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.FavipiravirThuốc kháng vi-rút đã được phê duyệtANDV(-) ssRNAChất ức chế RNA polymerase của virus0,044Virus cúm CAID 392526
2.NitazoxanideĐộng vật nguyên sinh được chấp thuậnADVdsDNAChất ức chế pyruvate0,21Virus viêm gan CAID 642456
3.RemdesivirĐiều tra kháng vi rútJUNV(-) ssRNAChất ức chế RNA polymerase của virus0,032MERS ‐ CoVGordon và cộng sự,  2020 )
4.Axit mycophenolicThuốc ức chế miễn dịch được chấp thuậnJUNV(-) ssRNAChất ức chế Inosine monophosphate dehydrogenase0,05Vi rút viêm nãoAID 588727
5.ChloroquineThuốc chống sốt rét được chấp thuậnKSHVdsDNAThuốc chống sốt rét; hóa trị liệu / cảm biến vô tuyến0,306HCoV ‐ OC43AID 558298
6.NiclosamideThuốc xổ giun được phê duyệtLASV(-) ssRNAkhông xác định0,1SARS coronavirusAID 297149
7.BCX4430 (Galidesivir)Thuốc kháng vi-rút đã được phê duyệtDENV(+) ssRNAChất ức chế RNA polymerase phụ thuộc RNA0,062Vi rút ZikaEyer và cộng sự,  2017 )
số 8.GemcitabineThuốc chống ung thư được chấp thuậnFLUAV(-) ssRNAChất chống chuyển hóa; Tương tự nucleoside1–5CVB3 và EV71Kang và cộng sự,  2015 )
9.Rapamycin (Sirolimus)Thuốc ức chế miễn dịch được chấp thuậnFLUAV(-) ssRNAChất ức chế tăng sinh tế bào T phụ thuộc IL-20,00018HIV1AID 406228
10.ABT ‐ 263 (Navitoclax)Điều tra chống ung thưFLUBV(-) ssRNAChất ức chế Bcl or 2 / Bcl ‐ xL0,46613MOLT ‐ 13AID 742372
11.CyclosporineThuốc ức chế miễn dịch được chấp thuậnHCV(+) ssRNACalcineurin inhibitor0.004HCV genotype 1bAID 555954
12.EmetineApproved antiprotozoalHEV‐B(+)ssRNAUnknown0.00874Zika virusBleasel & Peterson, 2020)
13.RibavirinApproved antiviralLASV(‐)ssRNANucleoside inhibitor0.04Hepatitis C virusAID 1306320
14.LuteolinApproved anticancerSARS‐CoV(+)ssRNAUnknown1.12Hepatitis C virusAID 658257
15.Tilorone (Amixin)Approved antiviralCHIKV(+)ssRNAInterferon inducer141.254Ebola virusAID 1117314
16.GlycyrrhizinApproved anti‐inflammatoryEBVdsDNAUnknown20SARS coronavirusAID 297145
17.EflornithineApproved antiprotozoalHEV‐B(+)ssRNAAn irreversible inhibitor of ornithine decarboxylase0.026Trypanosoma bruceiAID 1317209
18.MonensinApproved antibacterialHMPV(‐)ssRNAUnknown3.8DENV‐2Mazzon et al., 2019)
19.Arbidol (Umifenovir)Approved antiviralHSV‐1dsDNAUnknown12.2Chikungunya virusAID 1073347
20.SilvestrolInvestigational anticancerMERS‐CoV(+)ssRNAInhibitor of translation initiation by targeting the RNA helicase0.00189Chikungunya virusHenss et al., 2018)
21.AmiodaroneApproved antiarrhythmicRRV(+)ssRNANon‐competitive ß‐adrenergic inhibitor0 5.60Ebola virusBleasel & Peterson, 2020)
22.DasatinibApproved anticancerSARS‐CoV(+)ssRNAAbl; Src; Kit; EphR inhibitor5.47MERS‐CoVBleasel & Peterson, 2020)
23.LopinavirApproved antiviralSARS‐CoV‐2(+)ssRNAHIV protease inhibitor17MERS‐CoVBleasel & Peterson, 2020)
24.NelfinavirApproved antiviralCHIKV(+)ssRNAHIV protease inhibitor~0.95SIVDeng et al., 2012)
25.OritavancinApproved antibacterialEBOV(‐)ssRNATransglycosylation and transpeptidation inhibitor1.73Ebola virusZhou et al., 2016)
26.HydroxychloroquineApproved antimalarialHIV‐1ssRNA‐RTUnknown8.28MERS‐CoVBleasel & Peterson, 2020)
27.RitonavirApproved antiviralHIV‐1ssRNA‐RTHIV protease inhibitor0.00006HIVAID 82723
28.DalbavancinApproved antibacterialMERS‐CoV(+)ssRNAInhibits cathepsin L0.33Ebola virusZhou et al., 2016)
29.TeicoplaninApproved antibacterialMERS‐CoV(+)ssRNAPeptidoglycan polymerization inhibitor0.33Ebola virusZhou et al., 2016)
30.HomoharringtonineApproved anticancerSARS‐CoV‐2(+)ssRNAProtein translation inhibitor0.139Herpes simplex virus type 1Dong et al., 2018)
31.AlisporivirInvestigational antiviralHCoV‐229E(+)ssRNAUnknown0.008HIV1 subtype AAID 581785
32.CepharanthineApproved anti‐inflammatoryHCoV‐OC43(+)ssRNAUnknown4.7SW480 cellAID 745,562
33.HexachloropheneApproved antibacterialMERS‐CoV(+)ssRNAUnknown0.46HT‐29 viabilityAID 1117330
34.ImatinibApproved anticancerMERS‐CoV(+)ssRNAAbl; Kit; PDGFRB inhibitor1.75HCMVWolf et al., 2012)
35.NafamostatApproved anticoagulantMERS‐CoV(+)ssRNASynthetic serine protease inhibitor0.1MERS corona virusYamamoto et al., 2016)
36.ChlorpromazineApproved antipsychotic agentSARS‐CoV(+)ssRNAInhibits assembly of clathrin‐coated pits9.15MERS‐CoVBleasel & Peterson, 2020)
37.CamostatApproved anticancerFLUAV(‐)ssRNAUnknown0.00045SARS‐CoVZhou et al., 2015)
38.MemantineApproved anti‐Alzheimer’sFLUAV(‐)ssRNANmethylDaspartate glutamate receptor antagonist1.5NMDAAID 388528
39.IndomethacinApproved anti‐inflammatoryHIV‐1ssRNA‐RTCyclo‐oxygenase (COX) enzyme or prostaglandin G/H synthase inhibitor5SARS coronavirusAmici et al., 2006)
40.SaracatinibApproved anticancerMERS‐CoV(+)ssRNAUnknown0.0027NIH3T3AID 272211
41.TelavancinApproved antibacterialMERS‐CoV(+)ssRNABacterial cell wall synthesis inhibitor1.89Ebola virusZhou et al., 2016)
42.PromethazineApproved antihistamineSARS‐CoV(+)ssRNAInhibits assembly of clathrin‐coated pits11.8MERS‐CoVBleasel & Peterson, 2020)
43.TrametinibApproved anticancerFLUAV(‐)ssRNAMitogen activated protein‐kinase inhibitor0.004SW1463AID 1340171
44.MefloquineApproved antimalarialJCVdsDNAUnknown4.36Dengue virus type 2Bleasel & Peterson, 2020)
45.CordycepinInvestigational anticancer and Phase II (Leukemia)HSV‐1dsDNAPolyadenylation inhibitor0.0005Herpes simplex virus type‐1AID 216185

BẢNG 2. Tình trạng của tất cả các hợp chất được sử dụng trong nghiên cứu này chống lại các protein đích SARS ‐ CoV ‐ 2 để mô phỏng tương tác phân tử

Description: Chống corona bằng các thuốc

Chống corona bằng các thuốc

Ghi chú

  • Màu xanh lam đậm: Nuôi cấy tế bào / đồng nuôi cấy, màu vàng: Tế bào sơ cấp / cơ quan, màu xanh lá cây: mô hình động vật, màu hồng: Pha II, màu da cam: Pha III, màu tím: pha IV, màu đỏ: được phê duyệt, màu đen: dạng nghiên cứu.

2. Lựa chọn protein mục tiêu

Các protein mục tiêu liên kết với SARS ‐ CoV ‐ 2, cụ thể là vùng liên kết thụ thể protein đột biến (ID: 6VW1) và protease chính (6LU7), đã được sử dụng trong hiện tại học. Cấu trúc tinh thể của cả hai protein mục tiêu được lấy từ Ngân hàng Dữ liệu Protein RCSB. Các protein đích này đã được báo cáo về vai trò quan trọng của chúng trong quá trình lây nhiễm, sao chép, sống sót và nhân lên của SARS ‐ CoV ‐ 2 trong cơ thể vật chủ.

3. Mô phỏng tương tác phân tử

Tương tác giữa các phân tử giữa tất cả các ứng cử viên thuốc nghiên cứu và được FDA chấp thuận (Bảng  1 ) với các protein mục tiêu nói trên đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng Molegro Virtual Docker (phần mềm MVD 2010.4.0 cho windows ‐ 7, thử nghiệm). Việc lựa chọn vị trí tích cực và chuẩn bị protein được thực hiện bằng chương trình có sẵn của phần mềm. Hơn nữa, phức hợp protein-phối tử được tạo ra sau khi thả cùng với các tương tác hóa học đã được Discovery Studio phân tích và hình dung thêm cùng phần mềm Chimera.

4. Mô hình học máy để định vị lại

Các mô hình học máy Bayes (từ màn hình thuốc được FDA chấp thuận) từ phần mềm Assay Central đã được sử dụng để xác định khả năng của các hợp chất có thể hoạt động chống lại SARS ‐ CoV ‐ 2. Tổng cộng 45 phân tử thuốc từ các màn hình được báo cáo trước đây về các hoạt động kháng vi-rút chống lại các vi-rút khác nhau ở người đã được sử dụng để xác nhận khả năng tái tạo tiềm năng của chúng bằng cách sử dụng mô hình học máy Bayes. Mỗi mô hình trong Assay Central sử dụng các số liệu khác nhau để đánh giá hiệu suất dự đoán như thu hồi, độ chính xác, độ đặc hiệu, F1 ‐ Score, đường cong đặc tính hoạt động của máy thu (ROC), Cohen’s Kappa (CK) và hệ số tương quan Matthews (MCC). Các mô hình này sử dụng dấu vân tay kết nối mở rộng của bộ mô tả đường kính tối đa 6 (ECFP6) được tạo từ thư viện.

5. Mạng lưới dược lý của (các) hợp chất mạnh

Tương tác giữa protein và các hợp chất hoặc thuốc có hoạt tính sinh học là một phần không thể thiếu của các quá trình sinh học trong cơ thể sống. Trong nghiên cứu này, mạng lưới tương tác dược lý của (các) ứng cử viên thuốc hoạt động mạnh nhất (trong bối cảnh với các tương tác phân tử) được xác định bằng thuật toán STITCH (Công cụ tìm kiếm hóa chất tương tác). Tương tác giữa thuốc và các thụ thể bao gồm các liên kết trực tiếp (vật lý) và gián tiếp (chức năng) và được tạo ra bởi dự đoán tính toán từ việc chuyển giao kiến ​​thức giữa các sinh vật và từ các tương tác được tổng hợp từ các cơ sở dữ liệu khác (chính). Các tương tác trong STITCH được lấy từ các nguồn khác nhau như dự đoán ngữ cảnh bộ gen, (bảo tồn) đồng biểu hiện, khai thác văn bản tự động và kiến ​​thức trước đó trong cơ sở dữ liệu (Szklarczyk và cộng sự,  2016).

6. Mô hình chuỗi

Đặc điểm dược lý của (các) ứng cử viên thuốc hoạt động nhất về ái lực cao hơn với protein đích được xác định bằng cách sử dụng phần mềm Ligandscout, phần mềm này cũng cho thấy mối quan hệ hoạt động cấu trúc (SAR) với (các) mục tiêu sinh học cụ thể. Các tệp cấu trúc 3D được tối ưu hóa hoàn toàn của (các) ứng viên thuốc (định dạng Mol2) đã được tải vào không gian làm việc của phần mềm Ligandscout và các tính năng dược lý chính đã được xác định. Các đặc điểm dược lý duy nhất được xem xét trong quá trình phân tích là chất nhận liên kết H, chất cho liên kết H, chất cho liên kết halogen, kỵ nước, thơm, và các nhóm có thể ion hóa dương và âm.

7. Thử nghiệm độc tính tế bào

Dịch vụ xét nghiệm in vitro kháng vi rút SARS ‐ CoV ‐ 2 đã được Viện Khoa học và Công nghệ Sức khỏe Dịch thuật (THSTI), NCR Biotech Science Cluster, Faridabad ‐ 01, Haryana, Ấn Độ cung cấp. Vì hoạt tính kháng vi-rút đã được thử nghiệm trong tế bào Vero E6, nên (các) chất thử nghiệm, tức là, cordycepin, không được gây độc tế bào đối với tế bào chủ ở nồng độ thử nghiệm / s; do đó, thử nghiệm độc tính tế bào đã được thực hiện trước khi thử nghiệm kháng ‐ SARS ‐ CoV ‐ 2. Thử nghiệm được thực hiện trong định dạng đĩa 96 giếng (Thermo Scientific Nunc. Edge 2.0) ở 3 giếng cho mỗi mẫu. Tế bào 1x10e4 VeroE6 được gieo hạt trên mỗi giếng và ủ ở 37 ° C qua đêm để hình thành đơn lớp. Ngày hôm sau, các tế bào được ủ với chất thử nghiệm (cordycepin) ở các nồng độ khác nhau (1, 5, 10, 20 và 50 μM). Tế bào không có chất thử nghiệm được sử dụng làm đối chứng âm tính, và Remdesivir đã được sử dụng như một loại thuốc đối chứng tích cực. Sau 24 và 48 giờ, các tế bào được nhuộm bằng thuốc nhuộm màu cam Hoechst 33342 và Sytox. Hình ảnh được chụp ở 10X, 16 hình ảnh trên mỗi giếng, bao phủ 90% diện tích giếng bằng ImageXpress Microconfocal (Molecular Devices, LLC, San Jose, CA ‐ 95134 USA). Nhuộm axit nucleic Hoechst 33342 là một vết bẩn phản ứng hạt nhân thấm qua tế bào phổ biến phát ra huỳnh quang màu xanh lam khi liên kết với dsDNA. Nó nhuộm tất cả các tế bào sống và chết. Thuốc nhuộm màu cam Sytox nhuộm axit nucleic trong các tế bào có màng bị tổn thương. Vết bẩn này là dấu hiệu cho thấy tế bào chết. Cuối cùng, phần trăm khả năng sống sót của tế bào được xác định ở nhóm điều trị bằng cordycepin so với nhóm chứng không được điều trị. bao phủ 90% diện tích giếng bằng ImageXpress Microconfocal (Molecular Devices, LLC, San Jose, CA ‐ 95134 USA). Nhuộm axit nucleic Hoechst 33342 là một vết bẩn phản ứng hạt nhân thấm qua tế bào phổ biến phát ra huỳnh quang màu xanh lam khi liên kết với dsDNA. Nó nhuộm tất cả các tế bào sống và chết. Thuốc nhuộm màu cam Sytox nhuộm axit nucleic trong các tế bào có màng bị tổn thương. Vết bẩn này là dấu hiệu cho thấy tế bào chết. Cuối cùng, phần trăm khả năng sống sót của tế bào được xác định ở nhóm điều trị bằng cordycepin so với nhóm chứng không được điều trị. bao phủ 90% diện tích giếng bằng ImageXpress Microconfocal (Molecular Devices, LLC, San Jose, CA ‐ 95134 USA). Nhuộm axit nucleic Hoechst 33342 là một vết bẩn phản ứng hạt nhân thấm qua tế bào phổ biến phát ra huỳnh quang màu xanh lam khi liên kết với dsDNA. Nó nhuộm tất cả các tế bào sống và chết. Thuốc nhuộm màu cam Sytox nhuộm axit nucleic trong các tế bào có màng bị tổn thương. Vết bẩn này là dấu hiệu cho thấy tế bào chết. Cuối cùng, phần trăm khả năng sống sót của tế bào được xác định ở nhóm điều trị bằng cordycepin so với nhóm chứng không được điều trị. Thuốc nhuộm màu cam Sytox nhuộm axit nucleic trong các tế bào có màng bị tổn thương. Vết bẩn này là dấu hiệu cho thấy tế bào chết. Cuối cùng, phần trăm khả năng sống sót của tế bào được xác định ở nhóm điều trị bằng cordycepin so với nhóm chứng không được điều trị. Thuốc nhuộm màu cam Sytox nhuộm axit nucleic trong các tế bào có màng bị tổn thương. Vết bẩn này là dấu hiệu cho thấy tế bào chết. Cuối cùng, phần trăm khả năng sống sót của tế bào được xác định ở nhóm điều trị bằng cordycepin so với nhóm chứng không được điều trị.

8. Kiểm tra tiêu diệt ‐ SARS ‐ CoV ‐ 2

Tóm lại, xét nghiệm được thực hiện ở định dạng đĩa 96 ‐ (Thermo Scientific Nunc Edge 2.0) ở 3 giếng cho mỗi mẫu. Tế bào 1 × 10e4 được mạ trên mỗi giếng và ủ ở 37 ° C qua đêm để hình thành đơn lớp. Tế bào được ủ với môi trường nuôi cấy có cordycepin ở nồng độ mạnh không gây độc tế bào (10 μM) được xác định như đã đề cập ở trên. Ngay sau đó (trong vòng 5 phút), vi rút được thêm vào mỗi giếng ở một số lượng nhiễm trùng xác định (MOI; 0,1 trong 2 giờ). Tế bào đối chứng được ủ với môi trường nuôi cấy có nồng độ xe tương ứng. Sau đó, đĩa này được ủ ở 37 ° C và dịch nuôi cấy ở trên được thu hoạch ở 24 và 48 giờ sau đó. RNA virus được chiết xuất bằng cách sử dụng Kit QIAcube HT QIAcube HT của virus QIAamp 96 (Qiagen, Hilden, Đức) từ 100 μl dịch nuôi cấy. Phiên mã ngược được thực hiện bằng cách sử dụng kit BioLine SensiFAST cDNA (Bioline, London, Anh), hỗn hợp phản ứng tổng (20 μl), chứa 10 μl chiết xuất RNA, 4 μl đệm 5 × TransAmp, 1 μl men sao chép ngược và 5 μl nước không chứa nuclease. Các phản ứng được ủ ở 25 ° C trong 10 phút, 42 ° C trong 15 phút và 85 ° C trong 5 phút. qRT ‐ PCR (Hệ thống sinh học ứng dụng, Thành phố Foster, CA, Hoa Kỳ) được thực hiện bằng cách sử dụng điều kiện chu kỳ 95 ° C trong 2 phút, 95 ° C trong 5 giây và 60 ° C trong 24 giây, và giá trị Ct cho gen N và E. trình tự đã được xác định. Dữ liệu thu được được sử dụng để tính% ức chế vi rút, nếu có. Ramdesivir được sử dụng như một biện pháp kiểm soát tích cực (Caly và cộng sự, và giá trị Ct cho trình tự gen N và E đã được xác định. Dữ liệu thu được được sử dụng để tính% ức chế vi rút, nếu có. Ramdesivir được sử dụng như một biện pháp kiểm soát tích cực (Caly và cộng sự, và giá trị Ct cho trình tự gen N và E đã được xác định. Dữ liệu thu được được sử dụng để tính% ức chế vi rút, nếu có. Ramdesivir được sử dụng như một biện pháp kiểm soát tích cực.

9. Phân tích thống kê

Dữ liệu về điểm kết nối phân tử của năm tư thế khác nhau được biểu thị bằng giá trị trung bình ±  SD . Dữ liệu được phân tích bằng cách sử dụng ANOVA một chiều, theo sau là kiểm tra phạm vi của Tukey coi * p  ≤ 0,05 là các giá trị có ý nghĩa tĩnh.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Điểm cao nhất của tất cả các câu hỏi liên quan đến COVID ‐ 19 là; các lựa chọn điều trị hiệu quả nhất để chữa khỏi COVID ‐ 19 là gì? Để trả lời điều này, một trong nhiều cách tiếp cận có thể là sử dụng các loại thuốc kháng vi-rút đã có từ trước một mình hoặc kết hợp để chống lại COVID-19. Tương tự là trường hợp khi hydroxychloroquine được FDA chấp thuận đã được triển khai để điều chỉnh phản ứng tế bào bằng cách ức chế phản ứng viêm, do đó cải thiện chức năng cơ quan ở bệnh nhân COVID ‐ 19. Cho đến nay, không có phương pháp điều trị cụ thể nào đối với SARS ‐ CoV ‐ 2 được báo cáo để giải quyết tình trạng đại dịch. Trong bối cảnh này, định vị lại thuốc, còn được gọi là tái định vị hoặc tái chế, là một chiến lược độc đáo và thay thế để tạo ra giá trị bổ sung cho các loại thuốc đang điều tra hoặc đã được phê duyệt bằng cách nhắm mục tiêu vào bệnh khác với bệnh mà nó đã được báo cáo ban đầu. Điều này có một số lợi thế so với việc phát hiện ra thuốc mới vì tổng hợp hóa học, tiền lâm sàng (mô hình động vật) và thông tin lâm sàng (giai đoạn 0, I và IIa) bao gồm dữ liệu an toàn, liều lượng và kết quả dược động học đã có sẵn cho các phân tử có thể hỗ trợ nhanh quá trình phát triển thuốc. Do đó, nghiên cứu này được thực hiện với cam kết mạnh mẽ xác định (các) tác nhân điều trị tiềm năng chống lại SARS ‐ CoV ‐ 2 từ các ứng cử viên thuốc kháng vi rút hiện có bằng cách sử dụng phương pháp tính toán. Tiềm năng kháng vi-rút (Bảng  1 ) của tất cả các ứng cử viên thuốc được sử dụng trong nghiên cứu này đã được xác nhận trong nuôi cấy tế bào / đồng nuôi cấy, tế bào sơ cấp, mô hình động vật và giai đoạn II-IV và cũng được chấp thuận chống lại SARS ‐ CoV ‐ 2, HCoV ‐229E, HCoV ‐ OC43, MERS ‐ CoV và SARS ‐ CoV (Bảng  2).

1. Mô phỏng tương tác phân tử

Mô phỏng tương tác phân tử là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất, đặc biệt để xác định chì trong thiết kế thuốc có sự hỗ trợ của máy tính (CADD). Năng lượng liên kết tiết lộ mối quan hệ giữa các phối tử và phân tử thụ thể đích tương ứng của chúng. Năng lượng liên kết thấp hơn (âm) cho thấy ái lực cao hơn của phối tử đối với thụ thể. Glycoprotein lớn xuyên màng được glycosyl hóa nặng (loại I) của SARS ‐ CoV ‐ 2 có đặc điểm đáng chú ý và đóng một vai trò quan trọng trong quá trình gắn kết, dung hợp và xâm nhập vào cơ thể vật chủ của virus, và do đó, người ta cho rằng sự ức chế của protein đột biến có thể liên quan đến việc ức chế sự nhân lên của virus. Glycoprotein gai xuyên màng tồn tại ở dạng dị phân tử với ba chuỗi polypeptit riêng biệt: chuỗi A, B và C, tạo thành mỗi đơn phân. Glycoprotein tăng đột biến có hai miền chức năng, được đặt tên là S1 và S2, cả hai đều chịu trách nhiệm cho sự xâm nhập thành công của coronavirus vào tế bào chủ. Nghiên cứu tương tác phân tử cho thấy cordycepin có ái lực liên kết mạnh, theo sau là nitazoxanide, rapamycin, monensin, silvestrol, amiodarone, cepharanthine, indomethacin, promethazine và mefloquine với vùng SARS ‐ CoV ‐ 2 RBD (protein đột biến) (Hình  1 và 2). Cordycepin cho thấy các tương tác hóa học mạnh mẽ với miền RBD – giao diện ACE2 của con người với His34, Glu35 và Lys353 trong vị trí hoạt động (Hình  2 ).

Description: https://kienphucduong.vn/wp-content/uploads/2021/02/chua_corona_1.jpg

Hình 1

Điểm kết nối so sánh của các ứng viên thuốc khác nhau được hiển thị với protein đột biến SARS ‐ CoV ‐ 2. Dữ liệu là trung bình ±  SD của 5 tư thế khác nhau ( n  = 5), ANOVA một chiều, * p  ≤ 0,05

Description: Hình 2

Hình 2

Cấu trúc đế và tương tác hóa học của cordycepin được hiển thị cùng với các nguyên tử phối tử và tương tác axit amin trong các vị trí liên kết của protein đột biến SARS ‐ CoV ‐ 2

Điều đáng nói là tất cả các axit amin này đều nằm trong vùng giao diện của glycoprotein tăng đột biến và các thụ thể vật chủ, điều này cuối cùng tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nội bào qua trung gian thụ thể trong quá trình nhiễm trùng sơ cấp. Trong một nghiên cứu gần đây, người ta đã báo cáo rằng chất ức chế dung hợp pan ‐ coronavirus (EK1C4), nhắm mục tiêu protein đột biến, đã hạn chế thành công ( khoảng IC 50 : 1,3–15,8 nM) sự xâm nhập của virus vào tế bào chủ chống lại các loại coronavirus khác nhau như SARS ‐CoV, MERS ‐ CoV, SARS ‐ CoV ‐ 2, HCoV ‐ OC43 và SARSr ‐ CoVs.

Một mục tiêu thuốc bổ sung và hấp dẫn giữa các coronavirus là protease chính dài ~ 306 axit amin (M pro , 3CLpro), để ngăn chặn sự lây lan của bệnh bằng cách hạn chế sự phân cắt của polyprotein virus. M pro cần thiết để xử lý các polyprotein dẫn đến sự hoạt hóa phân giải protein của các protein chức năng của virus. Một phân tích tương tác phân tử silico cho thấy cordycepin (-205) liên kết mạnh với M pro, sau đó là monensin, promethazine, mefloquine, nitazoxanide, rapamycin, amiodarone, cepharanthine, silvestrol và indomethacin (Hình  3 ). M procác axit amin vị trí hoạt động như Thr26, Gly143, Cys145, Ser144, Leu141, His172, Phe140, Glu166, His163 và His164 đã tham gia vào quá trình tương tác hóa học với cordycepin (Hình  4 ).

Description: https://kienphucduong.vn/wp-content/uploads/2021/02/chua_corona_3.jpg

Hình 3

Điểm số gắn kết so sánh của các ứng cử viên thuốc khác nhau được hiển thị với các protease chính của SARS ‐ CoV ‐ 2. Dữ liệu là trung bình ±  SD của 5 tư thế khác nhau ( n  = 5), ANOVA một chiều, * p  ≤ 0,05

Description: Hình

Hình 4

Cấu trúc đế và các tương tác hóa học của cordycepin được hiển thị cùng với các nguyên tử phối tử và các axit amin tương tác trong các vị trí liên kết của M pro

2. Mô hình học máy để định vị lại

Phần mềm trung tâm Khảo nghiệm sử dụng Dấu vân tay Kết nối Mở rộng (ECFP6), một trong những công cụ tìm kiếm sự tương đồng phổ biến nhất trong việc khám phá thuốc. ECFP6 là các dấu vân tay tôpô tròn được thiết kế để mô tả đặc tính phân tử, tìm kiếm sự tương đồng và mô hình hóa cấu trúc – hoạt động. Thuật toán Bayes cũng hữu ích trong việc xác định các đạo trình duy nhất từ ​​một thư viện phân tử nhỏ có hoạt tính sinh học và độc tính tế bào mạnh. Mô hình Assay Central Bayesian cho bệnh do coronavirus, COVID ‐ 19 (SARS ‐ Cov ‐ 2), có đặc tính hoạt động của máy thu xác nhận chéo gấp năm lần (ROC) là 0,79, độ chính xác 0,76, độ thu hồi 0,76, độ đặc hiệu 0,78, điểm F1 ‐ 0,76, CK 0,53 và MCC 0,54 (Hình  5). Mô hình SARS protease có ROC xác nhận chéo gấp năm lần là 0,92, độ chính xác 0,85, độ thu hồi 0,98, độ đặc hiệu 0,78, điểm F1 0,90, CK 0,77 và MCC 0,79 (Hình  5 ). Đối với SARS ‐ CoV ‐ 2, điểm dự đoán và khả năng ứng dụng của cordycepin tương ứng là 0,60 và 0,47, trong khi đối với SARS, điểm dự đoán và khả năng ứng dụng của protease là 0,60 và 0,42. Kết quả được chứng thực thêm bằng cách so sánh IC 50 được báo cáo với điểm tương tác. Điều thú vị là hợp chất có IC 50 thấp đã cho thấy những tương tác hóa học mạnh mẽ với các protein mục tiêu (Hình  6 và 7) và tương tự là trường hợp với cordycepin. Ưu điểm của phương pháp này là phương pháp này hiệu quả hơn về thời gian và chi phí trong việc khám phá các phương pháp trị liệu mới, và thú vị là nó không yêu cầu cấu trúc tinh thể. Hơn nữa, nó cho phép các cấu trúc phân tử nhỏ được tính điểm dựa trên nhiều mô hình đồng thời. Một mô hình tương tự đã được sử dụng để xác định một chì thuốc lao, TCMDC ‐ 125802 thể hiện hoạt tính diệt khuẩn in vitro đầy hứa hẹn chống lại Mycobacterium tuberculosis với khả năng gây độc tế bào ở động vật có vú được chấp nhận và tính an toàn trên chuột in vivo.

Description: https://kienphucduong.vn/wp-content/uploads/2021/02/chua_corona_5.jpg

Hình 5

Đồ thị đường cong đặc tính hoạt động của máy thu xác nhận chéo gấp năm lần (ROC). Mô hình học máy Bayes sử dụng dấu vân tay ECFP6 được sử dụng để cho điểm và lựa chọn các hợp chất nhằm dự đoán ái lực liên kết mạnh đối với các protein mục tiêu SARS ‐ CoV ‐ 2

Description: https://kienphucduong.vn/wp-content/uploads/2021/02/chua_corona_6.jpg

Hình 6

Màn hình rađa hiển thị IC 50 so sánh của các hợp chất khác nhau được báo cáo về các hoạt động kháng vi-rút chống lại các vi-rút ở người khác nhau